分光光度定义

分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。常用的波长范围为：(1)200～400nm的紫外光区(2)400～760nm的可见光区,(3)2.5～25μm(按波数计为4000cm～400cm)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度计、可见光分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度，所有仪器应按照*计量检定规程或本附录规定，定期进行校正检定。

原理

分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系列分光装置，从而产生特定波长的光源，光线透过测试的样品后，部分光线被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。

单色光辐射穿过被测物质溶液时，被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式：

A=-lg(I/I。)=-lgT=kLc

式中 :A 为吸光度;

基本原理

I。为入射的单色光强度;

I 为透射的单色光强度;

T 为物质的透射率;

k 为摩尔吸收系数;

L 为被分析物质的光程，即比色皿的边长

c 为物质的浓度

物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后可用同样条件将该供试品配成溶液，测定其吸收度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区，除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收但可在一定条件下加入显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析。由于显色时影响呈色深浅的因素较多，且常使用单色光纯度较差的仪器，故测定时应用标准品或对照品同时操作。

分光光度计组成

分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。

仪器主要由光源、单色器、样品室、检测器、信号处理器和显示与存储系统组成。

光谱范围

包括波长范围为400~760 nm的可见光区和波长范围为200～400 nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源.

钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱光通过三棱镜折射后,可得到由红橙,黄绿,蓝靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源.

氢灯(或氘灯)的发射光谱:氢灯能发出185～400 nm波长的光谱可作为紫外光光度计的光源.

物质的吸收光谱(1)

如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱.

不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.

物质的吸收光谱(2)

当光线通过某种物质的溶液时透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收只有一部分光可透过溶液.

入射光= 反射光 + 分散光 + 吸收光 + 透过光

如果我们用蒸馏水(或组成此溶液的溶剂)作为"空白"去校正反射,分散等因素造成的入射光的损失则:

入射光 = 吸收光 十 透过光

分光光度计特点

1、采用高性能*光栅，波长精度更高;

2、采用进口钨灯，发光效率高，使用寿命长，功耗降低;

3、超大规模集成，T/A转换精度高，稳定性高;

4、微机系统的应用，使操作使用简单可靠。

分光光度计技术参数

波长范围：320∽1000nm

光谱带宽：4nm

杂散光：≤0.5%(在360nm处)

波长准确度：优于±2nm

透射比准确度：≤±1nmT

分光光度计操作方法

1.接通电源，打开仪器开关，掀开样品室暗箱盖，预热10分钟。

2.将灵敏度开关调至“1”档(若零点调节器调不到“0”时，需选用较*。)

3.根据所需波长转动波长选择钮。

4.将空白液及测定液分别倒入比色杯3/4处，用擦镜纸擦清外壁，放入样品室内，使空白管对准光路。

5.在暗箱盖开启状态下调节零点调节器，使读数盘指针指向t=0处。

6.盖上暗箱盖，调节“100”调节器，使空白管的t=100，指针稳定后逐步拉出样品滑竿，分别读出测定管的光密度值，并记录。

7.比色完毕，关上电源，取出比色皿洗净，样品室用软布或软纸擦净。

注意事项

1.该仪器应放在干燥的房间内，使用时放置在坚固平稳的工作台上，室内照明不宜太强。热天时不能用电扇直接向仪器吹风，防止灯泡灯丝发亮不稳定。

2.使用本仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理，以及各个操纵旋钮之功能。在未按通电源之前，应该对仪器的安全性能进行检查，电源接线应牢固，通电也要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再按通电源开关。

3.在仪器尚未接通电源时，电表指针必须于“0”刻线上，若不是这种情况，则可以用电表上的校正螺丝进行调节。

分光光度计日常维护

分析仪器工作者要懂得仪器的日常维护和对主要技术指标的简易测试方法，自己经常对仪器进行维护和测试，以保证仪器工作在*佳状态。

一、温度和湿度是影响仪器性能的重要因素。他们可以引起机械部件的锈蚀，使金属镜面的光洁度下降，引起仪器机械部分的误差或性能下降;造成光学部件如光栅、反射镜、聚焦镜等的铝膜锈蚀，产生光能不足、杂散光、噪声等，甚至仪器停止工作，从而影响仪器寿命。维护保养时应定期加以校正。应具备四季恒湿的仪器室，配置恒温设备，特别是地处南方地区的实验室。

二、环境中的尘埃和腐蚀性气体亦可以影响机械系统的灵活性、降低各种限位开关、按键、光电偶合器的可靠性，也是造成必须学部件铝膜锈蚀的原因之一。因此必须定期清洁，保障环境和仪器室内卫生条件，防尘。

三、仪器使用一定周期后，内部会积累一定量的尘埃，*好由维修工程师或在工程师指导下定期开启仪器外罩对内部进行除尘工作，同时将各发热元件的散热器重新紧固，对光学盒的密封窗口进行清洁，必要时对光路进行校准，对机械部分进行清洁和必要的润滑，*后，恢复原状，再进行一些必要的检测、调校与记录。